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异硫氰酸荧光素(FITC)比羧基荧光素活性更高，羧基荧光素在使用前需要激活。FITC主要与巯基反应，如还原型半胱氨酸的侧链，尤其是多肽或蛋白中的氨基。
对于许多应用来说，在化学合成过程中引入多肽荧光标记是很容易的。例如，在固相合成过程中，FITC可以与赖氨酸(Lys)或选择性地脱保护的鸟氨酸（ornithine）侧链，或合成过程中多肽的N端氨基发生反应。在N端标记时，建议在*后一个氨基与异硫氰酸酯和氨基反应生成的硫脲键之间引入烷基间隔器（alkyl spacer），如氨基乙酸(Ahx)。
链接切割需要酸性环境，在N端标记FITC的多肽需要环化形成荧光素，通常伴随着*后一个氨基酸的去除。然而，当有间隔剂时，如氨基乙酸，或当目标肽从树脂通过非酸性环境切断时，这是可以避免的。
空间位阻被认为是在荧光染料之前使用Ahx的主要原因，而不是FITC不能直接与多肽偶联的原因。Ahx或b-Ala可作为FITC标记多肽的间隔物。
多肽荧光标记技术一般来说，生物素、FITC等染料可以任意标记在多肽的N端或C端上。但是我们推荐N端标记，成功率更高，时间更短，操作更简单。由于多肽是从C端合成到N端，所以N端修饰是固相合成的*后一步，不需要额外的偶联步骤。相反，如果是c端标记，则需要额外的步骤，过程将更加复杂。
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